T4 DNA連接酶的作用原理

　　T4 DNA連接酶可以催化粘端或平端雙鏈DNA或RNA中毗鄰的5’磷酸基團(tuán)和3’ 羥基末端之間形成磷酸二酯鍵。酶還可以修復(fù)雙鏈DNA，RNA或DNA/RNA復(fù)合體中的單鏈切口，連接DNA的粘性和平末端，但是該酶對(duì)單鏈核酸無(wú)酶活性。

　　T4 DNA連接酶的作用過(guò)程可以分為3個(gè)步驟：

　　1、連接酶的賴(lài)氨酸活性位點(diǎn)對(duì)ATP的α-磷酸基團(tuán)親核攻擊，釋放PPi，并生成T4 DNA連接酶-AMP中間體。

　　2、DNA鏈的5' -磷酸基團(tuán)攻擊連接酶-AMP中間體，AMP被轉(zhuǎn)移到DNA鏈的5' -磷酸基團(tuán)上，生成DNA-腺苷酸中間體。

　　3、DNA鏈的3' -羥基進(jìn)攻5' -磷酸基團(tuán)，形成磷酸二酯鍵，釋放AMP。

　　使用注意事項(xiàng)：

　　1、使用前應(yīng)在室溫放置至融化或用手掌溫度輔助融化，然后置于冰上。不要加熱融化以免ATP降解。

　　2、T4 DNA Ligase對(duì)熱敏感，容易失活。使用時(shí)請(qǐng)放置冰上，用后立即置冰箱中冷凍保存。

　　3、如需在接反應(yīng)后滅活T4 DNA Ligase，可于65℃孵育10min即可。